反相色譜柱一般是由硅膠，有機/無機雜化硅膠或者聚合物作為基質(zhì)， C18作為鍵合相。典型反相色譜柱基于分析物與烷烴鏈之間的疏水相互作用，根據(jù)樣品組分的極性大小的差異而實現(xiàn)樣品組分的分離。該分離模式有賴于色譜柱多孔基質(zhì)內(nèi)的C18鍵合相的自由伸展構(gòu)象。

對于有機酸/堿類化合物，多羥基化合物以及偶氮類等極性化合物，由于含有羧基，氨基，羥基等可解離部分，其極性較大而不適合以經(jīng)典反相C18類鍵合相進行分離。其典型表現(xiàn)為容量因子K過小，導(dǎo)致該類化合物在死時間附近出峰。

對于這些極性化合物，雖然我們可以在做梯度分析方法開發(fā)時，選擇降低起始有機相的比例，甚至以純水相作為起始流動相來增大該類化合物的容量因子。但化合物色譜峰峰形會出現(xiàn)峰展寬以及嚴重的C18色譜柱固定相孔內(nèi)去濕現(xiàn)象（Dewetting）；在停泵并重新恢復(fù)流速后，會出現(xiàn)化合物保留時間減少，色譜峰峰形異常（峰分叉、峰拖尾）等方法重現(xiàn)性問題，尤其以拖尾zui為常見。

對于這些極性化合物該如何得到較好的保留，在這里且聽小編慢慢道來。

一 孔內(nèi)去濕現(xiàn)象（Dewetting）

反相HPLC一般以水作為弱洗脫相，以甲醇、乙腈等有機試劑作為強洗脫相。在運行梯度時，有機相的比例一般可在5%-100%范圍內(nèi)變化，以適應(yīng)不同樣品的分離需求。對于極性化合物來說，在典型的C18色譜柱上，即使有機相比例為5%亦不能夠做到有效保留。在進一步降低有機相比例（以至為零），就會引起色譜柱多孔內(nèi)表面以及固定鍵合相的去濕現(xiàn)象（Dewetting）。

如圖1A所示，5%及其以上有機相時，流動相可輕易浸入固定相基質(zhì)多孔內(nèi)，浸濕內(nèi)表面以及C18烷烴鏈，且C18鏈呈自由伸展構(gòu)象，可很好的與樣品組分的疏水部分發(fā)生相互作用實現(xiàn)適當?shù)谋Ａ簟．斒褂?00%水相的時候，如圖1B，雖然可以選擇增da色譜柱前段壓力的方式，使得純水相浸入基質(zhì)多孔內(nèi)部，卻無法實現(xiàn)對內(nèi)表面以及C18鏈的有效浸濕，此外由于色譜柱沿流動相流動方向上的壓力降現(xiàn)象（如圖2），使得整個色譜柱的浸濕狀態(tài)存在很大差異。當柱前壓減小時（如停泵），由于多孔內(nèi)部的強疏水性，純水相則被“排出”孔隙，導(dǎo)致去濕現(xiàn)象發(fā)生，如圖1C所示

C18鏈在孔內(nèi)去濕現(xiàn)象發(fā)生前后，在多孔內(nèi)的構(gòu)象如下圖3所示。在典型反相HPLC流動相下（水相≤95%），C18鏈在多孔內(nèi)呈現(xiàn)自由伸展構(gòu)象；在100%水相下， C18鏈則相互之間“交聯(lián)”并zui大程度的靠近內(nèi)表面，形成疏水屏蔽層，失去與待分離組分疏水部分相互作用的能力，導(dǎo)致保留時間變短。

二 極性化合物分離挑戰(zhàn)

以典型的反相C18色譜柱對極性化合物進行分離時，往往會出現(xiàn)保留時間過短，色譜峰峰形拖尾問題。保留時間過短往往是由于化合物本身或者在體系中解離之后極性過大，油-水分配系數(shù)過小而不能與疏水選擇性基團發(fā)生足夠的疏水相互作用，進而隨起始流動相一起直接流出色譜柱。

如有機酸類化合物在流動相pH大于其pKa時發(fā)生解離而本身帶負電，可與硅膠基質(zhì)上殘留的金屬離子發(fā)生靜電相互作用；有機堿類化合物在流動相pH小于其pKa時發(fā)生解離而本身帶正電，與弱酸性的硅羥基產(chǎn)生靜電相互作用；多羥基，羥基-胺類有機化合物以及未解離有機酸堿類化合物與硅羥基之間的氫鍵相互作用。以上三種“二級保留”相互作用，均會造成有機極性化合物的拖尾。此外，溶解極性化合物的溶劑選擇不合適的話，也會導(dǎo)致色譜峰拖尾現(xiàn)象。典型極性化合物如下圖4所示。

因此，極性化合物在反相色譜柱上做分析方法開發(fā)時主要面臨以下幾方面的問題：

（1）如何使得極性化合物具有適當?shù)谋Ａ魰r間；

（2）如何避免在使用高水比例甚至純水相洗脫時出現(xiàn)的孔內(nèi)去濕（相塌陷）問題；

（3）如何zui大可能地減小色譜峰拖尾因子，獲得優(yōu)異的峰形；

三 極性化合物分離策略

利用純水相洗脫方式對極性化合物進行分離，面臨色譜柱固定相孔內(nèi)去濕（相塌陷）問題，但可通過對經(jīng)典反相C18鍵合相進行改性，或者使用其他鍵合相以及使用Hilic分離模式，zui大程度地減小或避免該現(xiàn)象的發(fā)生，同時做到對極性化合物有效保留。

色譜柱孔內(nèi)去濕現(xiàn)象的發(fā)生以及程度的大小與色譜填料顆粒孔徑的大小，多孔內(nèi)表面鍵合相的鍵合密度，所用烷烴鏈長度、基質(zhì)表面裸露的硅羥基數(shù)量以及封端類型有關(guān)。

3.1 非封端短鏈烷烴鍵合固定相

這種類型的反相色譜柱主要特點有兩個：硅膠基質(zhì)表面裸露的硅羥基不封端以及鍵合固定相鏈長度小于C8。由于固定相烷烴鏈長度遠小于C18，多孔內(nèi)疏水性變小，加之表面硅羥基不封端使得純水相與多孔接觸角變小，與典型C18相比，發(fā)生孔內(nèi)去濕現(xiàn)象的可能性大大減小。與此同時，該種類型的色譜柱由于鍵合烷烴鏈長度較小，在對樣品組分分離的時候，吸附作用以及硅羥基氫鍵相互作用占主要地位。例如月旭Ultimate®XB-C1。

3.2 極性封端與極性增強型固定相

該型色譜柱采用極性或者親水性的封端試劑對表面裸露的硅羥基進行封端，C18的鍵合密度較低，這種改性方式與典型的C18色譜柱相比，增大了內(nèi)表面的水浸潤性且較低的鍵合密度也使得孔內(nèi)疏水性相對減小，因而允許使用100%水相。例如月旭Ultimate®ALK-C18。

3.3 極性內(nèi)嵌烷基固定相

這種類型的色譜柱在長鏈烷基靠近硅膠內(nèi)表面的一端，內(nèi)嵌入甲酸酯基類、脲或者酰胺基以及硫酰胺基等極性改性官能團。由于極性內(nèi)嵌，使得整個鍵合相的親水性增強，多孔內(nèi)疏水性減小，在100%水相條件下，極性內(nèi)嵌烷烴鏈依然保持自由伸展構(gòu)象。此外，內(nèi)嵌極性基團對表面裸露的硅羥基亦有一定的屏蔽作用，減小了極性化合物特別是堿性化合物的拖尾因子，色譜峰峰形更加對稱。例如月旭Ultimate®Polar-RP。

四 常用耐100%水相色譜柱

月旭常用的耐100%水相的反相色譜柱有：

典型反相HPLC色譜柱在使用100%水相對極性化合物進行分離分析時，易出現(xiàn)硅膠多孔內(nèi)去濕（相塌陷）現(xiàn)象，導(dǎo)致化合物保留時間減小，方法重現(xiàn)性出現(xiàn)問題。通過對色譜柱硅膠表面或者烷烴鏈改性，如增加內(nèi)表面極性大小以及烷烴鏈內(nèi)嵌極性官能團，使得多孔內(nèi)表面及固定相被水浸潤能力增加，而減少或避免孔內(nèi)去濕現(xiàn)象的發(fā)生。此外，也可通過調(diào)整HPLC操作方式以及改變色譜條件，對極性化合物的保留因子以及峰形進行調(diào)整。