各位小伙伴在實(shí)驗(yàn)分析中應(yīng)該都遇到過這類問題，在液相色譜中，對(duì)于組分復(fù)雜的樣品，采用一種色譜體系，往往很難得到理想的分離效果，要么分離時(shí)間太長(zhǎng)，要么分離度太差。這種情況，采用梯度洗脫就可以縮短分析時(shí)間，提高分離效果。下面和大家分享一則梯度微調(diào)實(shí)例，一起感受下梯度微調(diào)對(duì)分離效果的奇妙影響吧。

1、盡量在能長(zhǎng)時(shí)間測(cè)試該項(xiàng)目的儀器上開發(fā)方法；

2、需要了解系統(tǒng)的性能，避免出現(xiàn)儀器系統(tǒng)改變后不能重現(xiàn)的問題；

3、要知道系統(tǒng)的兩個(gè)基本情況：梯度滯后體積和比例精確性。這可以在同一個(gè)實(shí)驗(yàn)里得到這兩個(gè)數(shù)據(jù)：參考《JJG 705 2014液相色譜儀檢定規(guī)程》中《梯度誤差》實(shí)驗(yàn)：在B溶液（0.1%丙酮）后加紫外檢測(cè)器，設(shè)置一個(gè)多階層的梯度，B溶液以5%的幅度從0%變到100%，流速與平常一樣，流速為1mL/min。每段梯度大概保持5min。然后接二通運(yùn)行梯度，記錄圖譜。每段梯度設(shè)置的時(shí)間與實(shí)際發(fā)生的梯度時(shí)間之差就是梯度延遲時(shí)間，階層的高度可以用來測(cè)量流動(dòng)相比例，這些階層可能有點(diǎn)模糊，是由系統(tǒng)中混合體積造成的；

4、檢測(cè)完系統(tǒng)，就可以按照它的性能來設(shè)計(jì)方法。梯度方法轉(zhuǎn)換大的問題是梯度滯后體積，如果知道儀器的滯后體積比初開發(fā)方法的儀器大，就要自覺的在方法前加一段等度來抵消這一差別，如果目標(biāo)系統(tǒng)滯后體積小，就要在轉(zhuǎn)移方法的時(shí)候在方法開始加一段梯度延遲時(shí)間，如果比例差別是在梯度運(yùn)行中間出現(xiàn)的，也可以通過調(diào)節(jié)梯度圖譜來抵消這種差別，但是一般很少遇到過需要這么做的情況。

5、初始流動(dòng)相沒有充分平衡。柱子已經(jīng)用初始流動(dòng)相平衡了，但在分析中，梯度變化很快，而柱子沒有用初始流動(dòng)相充分平衡好，這樣di一針時(shí)總是與后面的不一樣。但是如果轉(zhuǎn)移到有不一樣滯后體積的系統(tǒng)時(shí)，可能就是另一種情況。

項(xiàng)目背景

名稱：12種酚類

色譜柱：月旭Ultimate ® AQ-C18 4.6mm*150mm,5μm

流動(dòng)相A：水   流動(dòng)相B：乙腈

問題：柱子正常活化進(jìn)樣，基線和整體出峰均不理想，分離度較差。

1.柱子在運(yùn)輸或儲(chǔ)存過程中保存液發(fā)生變化，導(dǎo)致填料產(chǎn)生微小改變，碳鏈蜷縮，未舒展開來，對(duì)目標(biāo)物的保留造成影響；

2.儀器系統(tǒng)存在梯度滯后，在梯度變化過程中，兩相混合不精準(zhǔn)，導(dǎo)致的物質(zhì)分離問題；

3.目標(biāo)物受溶劑效應(yīng)影響；

4.梯度變化過快，流動(dòng)相的洗脫能力太強(qiáng)，導(dǎo)致色譜峰未達(dá)到分離效果。

1.測(cè)試梯度滯后體積和比例精確性；

2.用初始流動(dòng)相0.2流速過夜平衡柱子；

3.樣品用初始流動(dòng)相溶解（慎用，改變樣品溶劑后需要驗(yàn)證樣品溶液的穩(wěn)定性）；

4.調(diào)節(jié)梯度，減緩洗脫速率，減小洗脫能力；

基線和峰形大有改善，但是后一個(gè)峰在梯度時(shí)間外出峰了。

梯度變化中，水相速率增長(zhǎng)較快，物質(zhì)保留變強(qiáng)，沒有獲得足夠的洗脫能力，后一個(gè)物質(zhì)出峰較晚。

前段分離好的梯度不做調(diào)整，調(diào)整后一個(gè)物質(zhì)出峰梯度階段的有機(jī)相比例，增加洗脫能力。

以上說明，項(xiàng)目的成功與否，不僅取決于色譜柱類型，儀器條件，還有方法的建立。其中流動(dòng)相便是考察重點(diǎn)，流動(dòng)相梯度洗脫必要時(shí)可以充分應(yīng)用上，他是由幾種不同極性的溶劑組成，通過改變流動(dòng)相中不同時(shí)間段各溶劑組成的比例改變流動(dòng)相極性，使每個(gè)流出的組分都有合適的容量因子，并使樣品的所有組分在短時(shí)間內(nèi)實(shí)現(xiàn)佳分離。好啦，今天的分享就先到這，希望能對(duì)小伙伴們有所啟發(fā)有所幫助哦。